化学应激对大蒜培养细胞SOD的诱导
作者：曾庆平 郭 勇
单位：曾庆平(广州中医药大学热带医学研究所，广州510407)；郭 勇(华南理工大学生物工程系，广州510641)
关键词：化学应激；水杨酸；自由基引发剂；SOD；诱导
药物生物技术990207
摘 要 采用化学诱导剂对大蒜培养细胞的超氧化物歧物酶(SOD)进行了体外诱导，供试诱导剂均能使SOD活力显著升高，诱导能力的大小依次为甲基紫精>水杨酸>甲基萘醌。水杨酸与冷胁迫或热休克复合处理比冷胁迫或热休克单独处理的SOD活力分别提高了1.5～2倍和2～4倍。结果表明水杨酸诱导的SOD以Mn.SOD和Fe.SOD为主，仅有少量Cu/Zn.SOD。
Induction of SOD by Chemical Stress
, http://www.100md.com
in Cultured Garlic Cells
Zeng Qingping, Guo Yong1
(Tropical Medicine Institute,Guangzhou University of Traditional Chinese
Medicine,Guangzhou 510407,1Department of Biotechnology,South China Unive rsity of Technology,Guangzhou 510641)
Abstract Induction of superoxide dismutase(SOD) in cultured garlic cells was performed in vitro by using several kinds of chemical inducers.The results showed that all inducers in present investigation dramatically increased SOD activity,and the potential for induction was the sequence as following:met hyl viologen>salicylic acid>menodione.It was also found that SOD activity was i ncreased as 1.5～2 fold and 2～4 fold,respectively,in the combined treatment of salicylic acid with chilling or with heat shock compared as those with a single treatment by chilling or by heat shock alone.The salicylic acid-induced SOD was mainly Fe.SOD and Mn.SOD,and only a trace of Cu/Zn.SOD.
, 百拇医药
Key Words Chemical stress,Salicylic acid,Free radical generator,SOD,I nduction
有氧代谢过程以及微体脂肪酸β-氧化和乙醛酸体光呼吸时的电子传递、外界环境污染(辐射，毒素，化学试剂)的影响以及感染和衰老等生理原因，都将使细胞内部产生大量的活性氧自由基[1]。若这些自由基得不到及时清除，则可启动细胞自杀程序而发生细胞凋亡[2]。然而，细胞通过产生非酶类抗氧化剂和合成抗氧化酶，可以有效地清除自由基。在一定范围内，氧化应激程度、抗氧化剂含量、细胞活力之间存在着一致关系。为了掌握植物细胞在化学污染环境中的抗氧化酶合成动态，我们采用体外化学应激模拟对大蒜培养细胞SOD的诱导进行了探讨。
1 材 料
白皮大蒜(Alliumsativum L.),广东产；肾上腺素购自瑞典Fulka公司，甲基萘醌(维生素K3)购自美国Sigma公司，甲基紫精购自英国Zeneca公司，培养基所需化学试剂均为市售国产分析纯产品。
, http://www.100md.com
2 方 法
2.1 大蒜细胞培养
将大蒜愈伤组织置于含2mg/L2，4-D和0.1mg/LKT的MS培养基中，25℃，1200Lx，12h/d，每3周继代1次。取3周龄愈伤组织，接种于25mlMS液体培养基中，25℃，130r/min振荡培养。
2.2 化学应激处理
将不同浓度的化学诱导剂溶液直接加至固体培养基中或将悬浮细胞转入用液体培养基配制的不同浓度的诱导剂溶液中，25℃，光下(1200Lx)处理不同时间。
2.3 SOD活力测定与SOD类型鉴别
见参考文献[3]。
3 结 果
, 百拇医药
3.1 化学诱导剂对培养细胞SOD诱导的动力学
3.1.1 水杨酸浓度及处理时间与SOD活力的关系 以不同浓度水杨酸处理大蒜悬浮培养细胞，并于24h后测定SOD活力。经0.5～1.0mmol/L水杨酸处理后，细胞的SOD活力显著升高，并且作用浓度与诱导效果呈现一定的依存性。
用1.0mmol/L水杨酸短时间(2～6h)或长时间(1～3d)处理大蒜悬浮培养细胞后，分别测定SOD活力。水杨酸短时间处理的细胞，其SOD活力逐渐增大，于4h时达到峰值，SOD活力为对照的1.7倍，随后有所下降。水杨酸长时间处理细胞的SOD活力也显著升高，但与短时间处理的差别不大，SOD活力为对照的1.7～1.9倍。
3.1.2 甲基紫精浓度与SOD活力的关系
以不同浓度的甲基紫精处理大蒜悬浮培养细胞，并于24h后测定其SOD活力。在0.05mmol/L浓度以下，其变化趋势为随浓度升高活力增强，最高可达2.4倍。
, http://www.100md.com
3.1.3 甲基萘醌浓度与SOD活力的关系
以不同浓度的甲基萘醌处理大蒜悬浮培养细胞，并于24h后测定SOD活力。低浓度甲基萘醌对SOD活力的诱导作用较强。随着浓度的逐渐增大，SOD活力不断下降。
3.2 水杨酸对物理应激反应的累加效应
3.2.1 水杨酸与冷胁迫的共同作用 在大蒜悬浮培养细胞中加入终浓度为0.5mmol/L水杨酸，置于4℃冰箱中，定时取样测定SOD活力，判断水杨酸对冷胁迫诱导是否具有强化作用，结果如图1所示。
Treatment 1：1.25℃，light,waterlogging
2.25℃，light
, http://www.100md.com
3.4℃，dark
Treatment 2：25℃，light,salicylic acid
Treatment 3：4℃，salicylic acid
Treatment 4：4℃，waterlogging
Treatment 5：4℃，light,waterlogging
冷胁迫细胞受水杨酸促进可以显著提高SOD活力，长时间光照处理比黑暗处理高2.08倍。
3.2.2 水杨酸与热休克的相互作用 在大蒜悬浮培养细胞中加入终浓度为0.5mmol/L水杨酸，置于40℃恒温水浴中，定时取样测定SOD活力，确认水杨酸对热休克诱导的强化作用，结果如图2所示。
, 百拇医药
Treatment 1:1. 25℃，light,waterlogging
2. 25℃，light
3. 4℃，dark
Treatment 2：25℃，light,salicylic acid
Treatment 3：40℃，salicylic acid
Treatment 4：40℃，waterlogging
Treatment 5：40℃，light,waterlogging
正如冷胁迫一样，热休克细胞也可受水杨酸促进而诱导较高的SOD活力，并以光照及长时间处理效果最好，比长时间黑暗处理高3.65倍。
, http://www.100md.com
3.3 水杨酸诱导SOD同工酶的分类
将水杨酸诱导的SOD用不同浓度的KCN的氯仿-乙醇处理，观察其对SOD活力的影响，用于判断水杨酸诱导SOD所属的类型，结果如表1所示。
Tab 1 Inhibition of salicylic acid-induced
SOD activity by specific inhibitors
Inhibition(%)
No inhibitor
0
0.05 mmol/L KCN
7.31
, 百拇医药
0.5mmol/L KCN
5.83
5%chloroform-ethnol
27.70
15%chloroform-ethnol
82.33
氯仿-乙醇可以有效地抑制水杨酸诱导产生的SOD，其抑制程度已达原活力的4/5，进一步证实这种SOD主要属于Mn.SOD和Fe.SOD。4 讨 论
光抑制、缺氧、缺水、外来物污染以及病菌或病毒感染等多种氧化应激均能诱导SOD活力增高。就化学诱导剂而言，以甲基紫精(即除草剂“百草枯”)研究较多。甲基紫精具有很强的氧化还原活性，它通过诱发自由基生成而使植物产生广泛的氧化损伤。在光照条件下，甲基紫精对菜豆的各种类型SOD均有强烈诱导作用[4]，而在黑暗条件下，甲基紫精可诱导玉米叶绿体Cu/ZnSOD的合成[5]。
, http://www.100md.com
本研究除证实甲基紫精能显著提高大蒜培养细胞的SOD活力外，还发现甲基萘醌和水杨酸也能诱导SOD。经水杨酸处理的细胞，其SOD活力比对照提高1.84倍，水杨酸与冷胁迫以及热休克相互作用诱导的SOD活力为对照的2.08倍和3.65倍。在有水杨酸持续存在的环境中，细胞在数天内仍能维持较高的SOD活力。我们曾发现淹水不利于冷胁迫或热休克对SOD的诱导，但水杨酸可以缓解这一负面效应而显著提高SOD活力。这一效果可能是以SOD的大量产生以及通过对冷胁迫与热休克诱导作用的强化而实现的。
目前除甲基紫精属于自由基引发剂已成定论外，水杨酸与甲基萘醌诱导的SOD的机理尚未阐明。我们的初步观察表明，水杨酸和甲基萘醌均能促进肾上腺素的自氧化(未发表结果)，喑示其引发或自发产生自由基可能为二者作用机理之一。Chen等[6]发现，过氧化氢酶(CAT)是水杨酸的胞内受体。当CAT与水杨酸结合后，可以阻断H2O2的酶促转变，而H2O2的积累又能激活信号传导系统，从而诱导抗性保护基因的表达。我们证明水杨酸诱导的SOD主要是Mn.SOD和Fe.SOD，仅有少量Cu/Zn.SOD。据此可以推测，水杨酸可能主要通过作用于富含CAT的细胞器(如微体等)而诱导特异性SOD合成。对此，我们将作进一步探讨。
, 百拇医药
参考文献
1 Bowler C,Van Montagu M,Inze D,Superoxide dismutase and stress toleran ce.Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol,1992,43∶83
2 Thompsonn C B.Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease.Scie nce,1995,267∶1456
3 曾庆平，郭勇.物理应激对大蒜培养细胞SOD的诱导.药物生物技术，1998，5(3)∶153
4 Chia L S,McRae D G,Thompson J E.Light-dependence of paraquat-initiated mem brane deterioration in bean plants:evidence for the involvement of superoxide. Physiol Plant,1982,56∶492
, 百拇医药
5 Matters G L,Scandalios J G. Effect of the free radical generating herbicide paraquat on the expression of the superoxide dismutase(SOD)genes in maize.Bio chim Biophys Acta,1986,882∶29
6 Chen Z X,Silva H,Klessig D F.Active oxygen species in the induction of plant systemic acquired resistance by salicylic acid.Science,1993,262∶1883
收稿日期:1998-03-30, 百拇医药
单位：曾庆平(广州中医药大学热带医学研究所，广州510407)；郭 勇(华南理工大学生物工程系，广州510641)
关键词：化学应激；水杨酸；自由基引发剂；SOD；诱导
药物生物技术990207
摘 要 采用化学诱导剂对大蒜培养细胞的超氧化物歧物酶(SOD)进行了体外诱导，供试诱导剂均能使SOD活力显著升高，诱导能力的大小依次为甲基紫精>水杨酸>甲基萘醌。水杨酸与冷胁迫或热休克复合处理比冷胁迫或热休克单独处理的SOD活力分别提高了1.5～2倍和2～4倍。结果表明水杨酸诱导的SOD以Mn.SOD和Fe.SOD为主，仅有少量Cu/Zn.SOD。
Induction of SOD by Chemical Stress
, http://www.100md.com
in Cultured Garlic Cells
Zeng Qingping, Guo Yong1
(Tropical Medicine Institute,Guangzhou University of Traditional Chinese
Medicine,Guangzhou 510407,1Department of Biotechnology,South China Unive rsity of Technology,Guangzhou 510641)
Abstract Induction of superoxide dismutase(SOD) in cultured garlic cells was performed in vitro by using several kinds of chemical inducers.The results showed that all inducers in present investigation dramatically increased SOD activity,and the potential for induction was the sequence as following:met hyl viologen>salicylic acid>menodione.It was also found that SOD activity was i ncreased as 1.5～2 fold and 2～4 fold,respectively,in the combined treatment of salicylic acid with chilling or with heat shock compared as those with a single treatment by chilling or by heat shock alone.The salicylic acid-induced SOD was mainly Fe.SOD and Mn.SOD,and only a trace of Cu/Zn.SOD.
, 百拇医药
Key Words Chemical stress,Salicylic acid,Free radical generator,SOD,I nduction
有氧代谢过程以及微体脂肪酸β-氧化和乙醛酸体光呼吸时的电子传递、外界环境污染(辐射，毒素，化学试剂)的影响以及感染和衰老等生理原因，都将使细胞内部产生大量的活性氧自由基[1]。若这些自由基得不到及时清除，则可启动细胞自杀程序而发生细胞凋亡[2]。然而，细胞通过产生非酶类抗氧化剂和合成抗氧化酶，可以有效地清除自由基。在一定范围内，氧化应激程度、抗氧化剂含量、细胞活力之间存在着一致关系。为了掌握植物细胞在化学污染环境中的抗氧化酶合成动态，我们采用体外化学应激模拟对大蒜培养细胞SOD的诱导进行了探讨。
1 材 料
白皮大蒜(Alliumsativum L.),广东产；肾上腺素购自瑞典Fulka公司，甲基萘醌(维生素K3)购自美国Sigma公司，甲基紫精购自英国Zeneca公司，培养基所需化学试剂均为市售国产分析纯产品。
, http://www.100md.com
2 方 法
2.1 大蒜细胞培养
将大蒜愈伤组织置于含2mg/L2，4-D和0.1mg/LKT的MS培养基中，25℃，1200Lx，12h/d，每3周继代1次。取3周龄愈伤组织，接种于25mlMS液体培养基中，25℃，130r/min振荡培养。
2.2 化学应激处理
将不同浓度的化学诱导剂溶液直接加至固体培养基中或将悬浮细胞转入用液体培养基配制的不同浓度的诱导剂溶液中，25℃，光下(1200Lx)处理不同时间。
2.3 SOD活力测定与SOD类型鉴别
见参考文献[3]。
3 结 果
, 百拇医药
3.1 化学诱导剂对培养细胞SOD诱导的动力学
3.1.1 水杨酸浓度及处理时间与SOD活力的关系 以不同浓度水杨酸处理大蒜悬浮培养细胞，并于24h后测定SOD活力。经0.5～1.0mmol/L水杨酸处理后，细胞的SOD活力显著升高，并且作用浓度与诱导效果呈现一定的依存性。
用1.0mmol/L水杨酸短时间(2～6h)或长时间(1～3d)处理大蒜悬浮培养细胞后，分别测定SOD活力。水杨酸短时间处理的细胞，其SOD活力逐渐增大，于4h时达到峰值，SOD活力为对照的1.7倍，随后有所下降。水杨酸长时间处理细胞的SOD活力也显著升高，但与短时间处理的差别不大，SOD活力为对照的1.7～1.9倍。
3.1.2 甲基紫精浓度与SOD活力的关系
以不同浓度的甲基紫精处理大蒜悬浮培养细胞，并于24h后测定其SOD活力。在0.05mmol/L浓度以下，其变化趋势为随浓度升高活力增强，最高可达2.4倍。
, http://www.100md.com
3.1.3 甲基萘醌浓度与SOD活力的关系
以不同浓度的甲基萘醌处理大蒜悬浮培养细胞，并于24h后测定SOD活力。低浓度甲基萘醌对SOD活力的诱导作用较强。随着浓度的逐渐增大，SOD活力不断下降。
3.2 水杨酸对物理应激反应的累加效应
3.2.1 水杨酸与冷胁迫的共同作用 在大蒜悬浮培养细胞中加入终浓度为0.5mmol/L水杨酸，置于4℃冰箱中，定时取样测定SOD活力，判断水杨酸对冷胁迫诱导是否具有强化作用，结果如图1所示。
Treatment 1：1.25℃，light,waterlogging
2.25℃，light
, http://www.100md.com
3.4℃，dark
Treatment 2：25℃，light,salicylic acid
Treatment 3：4℃，salicylic acid
Treatment 4：4℃，waterlogging
Treatment 5：4℃，light,waterlogging
冷胁迫细胞受水杨酸促进可以显著提高SOD活力，长时间光照处理比黑暗处理高2.08倍。
3.2.2 水杨酸与热休克的相互作用 在大蒜悬浮培养细胞中加入终浓度为0.5mmol/L水杨酸，置于40℃恒温水浴中，定时取样测定SOD活力，确认水杨酸对热休克诱导的强化作用，结果如图2所示。
, 百拇医药
Treatment 1:1. 25℃，light,waterlogging
2. 25℃，light
3. 4℃，dark
Treatment 2：25℃，light,salicylic acid
Treatment 3：40℃，salicylic acid
Treatment 4：40℃，waterlogging
Treatment 5：40℃，light,waterlogging
正如冷胁迫一样，热休克细胞也可受水杨酸促进而诱导较高的SOD活力，并以光照及长时间处理效果最好，比长时间黑暗处理高3.65倍。
, http://www.100md.com
3.3 水杨酸诱导SOD同工酶的分类
将水杨酸诱导的SOD用不同浓度的KCN的氯仿-乙醇处理，观察其对SOD活力的影响，用于判断水杨酸诱导SOD所属的类型，结果如表1所示。
Tab 1 Inhibition of salicylic acid-induced
SOD activity by specific inhibitors
Inhibition(%)
No inhibitor
0
0.05 mmol/L KCN
7.31
, 百拇医药
0.5mmol/L KCN
5.83
5%chloroform-ethnol
27.70
15%chloroform-ethnol
82.33
氯仿-乙醇可以有效地抑制水杨酸诱导产生的SOD，其抑制程度已达原活力的4/5，进一步证实这种SOD主要属于Mn.SOD和Fe.SOD。4 讨 论
光抑制、缺氧、缺水、外来物污染以及病菌或病毒感染等多种氧化应激均能诱导SOD活力增高。就化学诱导剂而言，以甲基紫精(即除草剂“百草枯”)研究较多。甲基紫精具有很强的氧化还原活性，它通过诱发自由基生成而使植物产生广泛的氧化损伤。在光照条件下，甲基紫精对菜豆的各种类型SOD均有强烈诱导作用[4]，而在黑暗条件下，甲基紫精可诱导玉米叶绿体Cu/ZnSOD的合成[5]。
, http://www.100md.com
本研究除证实甲基紫精能显著提高大蒜培养细胞的SOD活力外，还发现甲基萘醌和水杨酸也能诱导SOD。经水杨酸处理的细胞，其SOD活力比对照提高1.84倍，水杨酸与冷胁迫以及热休克相互作用诱导的SOD活力为对照的2.08倍和3.65倍。在有水杨酸持续存在的环境中，细胞在数天内仍能维持较高的SOD活力。我们曾发现淹水不利于冷胁迫或热休克对SOD的诱导，但水杨酸可以缓解这一负面效应而显著提高SOD活力。这一效果可能是以SOD的大量产生以及通过对冷胁迫与热休克诱导作用的强化而实现的。
目前除甲基紫精属于自由基引发剂已成定论外，水杨酸与甲基萘醌诱导的SOD的机理尚未阐明。我们的初步观察表明，水杨酸和甲基萘醌均能促进肾上腺素的自氧化(未发表结果)，喑示其引发或自发产生自由基可能为二者作用机理之一。Chen等[6]发现，过氧化氢酶(CAT)是水杨酸的胞内受体。当CAT与水杨酸结合后，可以阻断H2O2的酶促转变，而H2O2的积累又能激活信号传导系统，从而诱导抗性保护基因的表达。我们证明水杨酸诱导的SOD主要是Mn.SOD和Fe.SOD，仅有少量Cu/Zn.SOD。据此可以推测，水杨酸可能主要通过作用于富含CAT的细胞器(如微体等)而诱导特异性SOD合成。对此，我们将作进一步探讨。
, 百拇医药
参考文献
1 Bowler C,Van Montagu M,Inze D,Superoxide dismutase and stress toleran ce.Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol,1992,43∶83
2 Thompsonn C B.Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease.Scie nce,1995,267∶1456
3 曾庆平，郭勇.物理应激对大蒜培养细胞SOD的诱导.药物生物技术，1998，5(3)∶153
4 Chia L S,McRae D G,Thompson J E.Light-dependence of paraquat-initiated mem brane deterioration in bean plants:evidence for the involvement of superoxide. Physiol Plant,1982,56∶492
, 百拇医药
5 Matters G L,Scandalios J G. Effect of the free radical generating herbicide paraquat on the expression of the superoxide dismutase(SOD)genes in maize.Bio chim Biophys Acta,1986,882∶29
6 Chen Z X,Silva H,Klessig D F.Active oxygen species in the induction of plant systemic acquired resistance by salicylic acid.Science,1993,262∶1883
收稿日期:1998-03-30, 百拇医药